1994 年10 月27 日ICII 指导委员会通过
1．介绍
本文件是讨论药物在欧盟、日本、美国注册申请时，递交的分析方法论证所需考虑的参数，它并不寻求涵盖到世界上其他地区注册或出口所要求的测试。另外，本文汇集了术语及其定义，但不对如何完成论证进行指导。希望通过这些术语和定义使欧盟、日本、美国通常存在于各种纲要与管理机构之间的差异得以沟通。
分析方法的论证是为了证明与预期目的相适应，以表格形式汇总了适用于鉴别、杂质控制、含量测定方法的特性，其他一些分析方法可在日后增加。
2．需论证的分析方法．类型
分析方法的论证讨论了四种最常见的类型：
—鉴别试验；
—杂质的定量试验；
—杂质控制的限度试验；
—原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组分的定量试验。
虽然许多其他分析方法，如制剂的溶出度试验、原料药粒度检查，没有在分析方法论证的初始文本中提及，但这些方法的论证和本资料所列内容同等重要，可能在以后的文件中提出。
本文件讨论的试验类型简述如下：
—鉴别试验旨在确证样品中的一种被测物的特性。通常将标准品和样品的性质(如光谱、色谱行为、化学反应性等)和参比对照品进行比较对照。—杂质检查是指样品中杂质的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的
纯度，而两种检测方法的论证项目是不同的。—含量测定是指测定样品中被分析物的含量。本文件中含量测定是指原料药中主要成分的定量测定，类似的论证项目也适用于制剂中的活性组分或其他指定成分的定量测定，以及其他与含量测定相关的分析方法(如溶出度)。应清楚了解分析方法的目的，因为这将决定需评价的论证项目。典型的论证项目如下：
·准确性
·精密度
重复性
中间精密度
·专属性
·检测限度
·定量限度
·线性
·范围
各论证项目的定义见后面的术语表。表中列举了在不同类型分析方法论证中被认为是最重要的项目，对所列举的分析方法来说，表中列出最典型的项目，但偶有例外，仍应根据具体情况而定。值得一提的是表中没有列出耐用性(Robustness)，但在分析方法研究过程的适当阶段应予以考虑。
下列情况需重新论证：
—原料药合成方法的改变；
—成品组分发生改变；
—分析方法的改变。
需要重新论证的程度，应根据改变的情况而定。某些其他的改变可能也要求论证。
表：
术 语
1．分析方法
分析方法是指进行分析的方式，应详细描述进行每个分析试验所必需的步骤。它包括但不局限于：样品、参比对照品、试剂的配制、仪器的使用、标准曲线的绘制、计算公式的运用等。
2．专属性
专属性是指在一些可能存在的组分，如杂质、降解物、基质等存在时，对被分析物准确可靠测定的能力。一种分析方法缺乏专属性时，可由其他辅助的分析方法作补充。
专属性有以下含义：
鉴别：确证被分析物符合其特性。
纯度检查：确保采用的分析方法可检出被分析物中杂质的准确含量，如有关物质、重金属、溶剂残留量等。
含量测定(含量或效价)：提供样品中被分析物的含量或效价的难确结果。
3．准确性
分析方法的准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近程度。
准确性有时也称真实度。
4．精密度
分析方法的精密度指的是规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测结果的接近程度(离散程度)。精密度可以从三个层次考虑：重复性、中间精密度、重现性。
精密度考察应使用均质的、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品或样品溶液进行研究。
分桥方法的精密度通常以多次测量结果的变异性、标准偏差或变异系数采表达。
4．1 重复性
重复性是指在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度，也称为间隙测量精密度。
4．2 中间精密度
中间精密度是指试验室内部条件改变，如不同日、不同分析者、不同仪器等情况下的精密度。
4．3 重现性
重现性是指不同实验室之间的精密度(合作研究，通常用于方法学的标难化)。
5．检测限度
某一分析方法的检测限度是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。
6．定量限度
某一分析方法的定量限度是指在合适的难确性和精密度下，能够定量测定样品中被分析物的最低量。它是样品中含量低的化合物定量测定的参数，特别适用于杂质和(或)降解产物的测定。
7．线性
分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度(量)成比例关系的能力。
8．范围
分析方法的范围是指样品中被分析物的较高浓度(量)和较低浓度(量)的一个区间，并已证实在此区间内，该方法具有合适的准确性、精密度和线性。
9．耐用性
分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变时，测量保持不受影响的能力，可用于说明正常使用时的可靠性。
分析方法的论证：方法学
介 绍
Q2A 阐述了分析方法论证中应考虑的项目，，本文件是对Q2A 的补充，其目的是对每一种分析方法的各种论证项目提供指导和建议。在某些情况下(如专属性论证)为了确保原料药和制剂的质量，应对一些综合起来的分析方法的总体能力进行研究。此外，文件对在申报中必须要递交的资料作了指导。
所有论证中的相关数据和论证项目的计算公式都应申报并进行讨论。
指导原则中末提到的方法，也可应用和采纳。申报者的责任应是选择最适合他们产品的论证方法和草案。但要切记，分析方法论证的主要目的是证明其适合于预期目的。对于生物技术产品和生物制品，由于它们的复杂特性，在某些情况下，其分析方法也许与本文件中提到的方法不同。
在整个方法学论证研究过程中，必须使用已鉴定并标示纯度的参比物，其纯度要求取决于预期用途。
与Q2A 一样，为清楚起见，本文件在各独立的章节中考虑了不同的论证内容，这些章节的排列反映了建立和评估一种分析方法的过程。
事实上在进行实验设计时，通常可以同时考虑合适的论证项目，以了解分析方法分析能力的合理性和总体情况，如：同时考虑专属性、线性、范围、准确性和精密度。
1．专属性
在鉴别、杂质和含量测定的方法学论证中应进行专属性研究，证明专属性的方法将取决
于分析方法的预期目的。
一般一种分析方法不太可能对某一特定的被分析物具有专属性(完全鉴定)，在此情况下，建议采用两种或两种以上的分析方法以达到能鉴定的水平。
1．1 鉴别
合适的鉴别试验应能区别出可能存在结构相似的化合物。可以通过与已知参比物比较，从含有被分析物的样品中得到的正结果和不含被分析物的样品中得到的负结果来确定。此外，鉴别试验也可以取与被测物结构相似或相关的物质来试验而得不到正反应来证实。在考虑可能会造成干扰的前提下，应根据合理科学的判断来选择可能存在的干扰物。
1．2 含量测定和杂质检查
产色谱方法中，应用典型的色谱图来证明专属性，并在图上恰当地标出每一种成分，其他分离技术也应如此。在色谱方法中，应在一等程度上考察关键性的分离。对关键性分离，可用两个洗脱程度最接近的化合物的分离度来证明其专属性。当非专属性方法测定含量时，可用其他辅助性的分析方法来证实整个方法的专属性，如：用滴定法来测定出厂原料药的含量，可结合使用和是的杂质检查方法。下述方法均适用于含量测定和杂质检查
1．2．1 可以得到杂质的情况
对含量测定来说，专属性应包括提供被分析物在杂质和(或)赋形剂存在时能被区分的证明，实际操作中可以在纯物质(原料或制剂)中加入一定量的杂质或辅料，与未加杂质或辅料的样品测定结果相比较，以证明其含量测定结果不受这些物质的影响。对杂质检查采说，通过加入含有一定量杂质的原料药或制剂，证明各杂质之间能分离，并也能与样品基质中其他组分分离。
1．2．2 无法得到杂质的情况
如果杂质或降解物的对照品不能得到，专属性可以通过路含一定量的杂质或降解产物的样品测定结果与另一种成熟的方法测定结果比较，如药典方法或经论证的其他方法(独立的方法)进行比较来证实。必要时，应包括放置在强力破坏试验条件下，即光、热、湿度、酸碱破坏及氧化情况下的样品的测定。
一对于含量测定，需要比较两种方法的结果。
一对于杂质检查，要比较杂质的概况。
峰的纯度试验是很有用的，它显示被测物色谱峰是单个还是多个成分(如二极管阵列、质谱)。
2． 线性
线性是在分析方法的范围内(见第3 节)对方法进行评价。可用所建议的分析方法，直接对原料药(用标准储备溶液稀释)和(或)对分别称取制剂组分的混合物进行测定，以证明其线性。
线性关系应以信号对被分析物的浓度或含量做图，根据图形是否线性进行评价。如果有线性关系，可用适当的统计方法估算试验结果，如最小二乘法。在某些情况下为使分析指标和样品浓度呈线性关系，在回归分析前应对测试数据进行数学转换。由线性回归估算所测得的数据本身又有助于数学评价线性的程度。上报资料中应含相关系数、y 轴上的截距、回归线的斜率、剩余方差，还应包括数据图表。另外，分析真值与回归线的偏差也有助于对线性作评价。
一些分析方法，如免疫测定法，在任何转换后，均不能证明呈线性，在这种情况下，分析的响应值应用样品中被分析物的浓度(含量)的适当函数来表示。
为建立线性，建议至少用5 个浓度。若用其他方法则应证明其合理性。
3． 范围
特定的范围一般是从线性研究中得到的，它依赖于分析方法应用目的。确定范围的方法是：样品中含有被分析物的量在范围内或在范围末端，该分析方法均能获得良好的线性、精密度和准确性。
至少应考虑如下最小的规定范围：
一对原料药或成品的含量测定：测试浓度范围一般应在80％一120％内。
一对含量均匀度检查：应在测试浓度70％一130％内，超出此范围，应有正当理由，主要是根据剂型的特点(如计量型的吸入剂)。
一对于溶出度试验，应为规定范围的± 20％，例如：如果是控释制剂，规定1 小时后达到20％，24 小时后为90％以上，它的合理范围应为标示量的0—110％。
—对于杂质检查，应为杂质的报告水平至标准规定的120％。对已知有异常功效的、有毒的或有意外药理作用的杂质，其检测限度和定量限度应与该杂质必须被限制的水平相当。注意：在研制阶段进行杂质检查方法论证时，有必要根据建议(可能)的限度来考虑范围。
一如果用一个试验同时进行含量测定和纯度检查，且仅使用100％的标难品，线性范围应覆盖杂质的报告水平强标准规定含量的120％。
4．准确性
应在分析方法规定的范围内建立准确性。
4．1 含量测定
4．1．1 原料药
下列几种方法可用于测定准确性：
(a)用该分析方法去测定已知纯度的被分析物(如参比物质)
(b)将建议采用的分析方法的结果与另一种成熟的分析方法的结果比较，后者的准确度是已知的(独立的方法，见1．2 节)。
(c)准确性可以在精密度1 线性和专属性建立后，推论而得。
4．1．2 制剂
下列几种方法可用于测定准确性：
(a)用该分析方法去测定按处方量制成的混合物，其中加入了已知量的原料药。
(b)在不能获得制剂所有组分的情况下，可以将已知量的被分析物加入到制剂中，或者将测得结果与另一种已。鉴定的分析方法分析的结果进行比较，后者的准确度是已知的(独立的方法，见1．2 节)。
(c)准确性可以在精密度、线性和专属性建立后，推论而得。
4．2 杂质(定量)
准确性应使用在样品中(原料药刷剂)加入已知量杂质的方式来评价。
在不能获得含有确定杂质和(或)降解产物的样品情况下，可以考虑与其不同的方法(见1．2 节)测得的结果比较。可以使用原料药的响应因子。
应明确如何测定单个或总的杂质，如：相对于主要被分析物所占的重量百分比或面积百分比。
4．3 申报数据
准确性的评价需要对至少能涵盖所规定的线性范围的3 种浓度，至少测定9 次(如按完整分析步骤对3 种浓度分别测定3 次)。
准确性可通过在样品中加入已知量的被分析物测得的百分回收率或平均值与真值的差异及其置信区间来报告。
5．精密度
含量测定和杂质定量测定的论证，均包括对精密度的考察。
5．1 重复性
重复性的评价：
(1)在方法的规定线性范围内至少测定9 次(如3 种浓度同种方法重复测定3 次)，或
(2)在100％的试验浓度，至少测定6 次。
5．2 中间精密度
中间精密度的考察程度应根据方法使用的环境而定，申请者应确定随机事件对分析方法精密度的影响。需研究的典型变异包括：日期、分析者、仪器等，没有必要逐个考察每个因素。鼓励使用试验设计(矩阵)。
5．3 重现性
重现性通过试验室之间的试验来评价，如果方法需要标准化，如收载到药典中的方法，则应考虑重现性。这些资料不是申请上市文档的一部分。
5．4 申报数据
在每一种精密度研究中都必须报告标难差1 相对标难差(变异系数)和置信区间。
6．检测限度
根据分析方法是采用非仪器分析还是仪器分析可用几种方法来确定检测限度，除了下面所列的方法外其他的方法也可能被接受。
6．1 根据直观评价
直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。
检测限度的测定是通过对一系列已知浓度分析物的样品进行分析，并以能准确测得被分析物的最小量来建立。
6．2 根据信噪比
该方法仪适用于出现基线噪音的分析方法。
信噪比的测定是通过比较含已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测试信号，确定被分析物可被确切地检测的最小浓度，当信噪比在3：1 或2：1 时的检测限度通常被接受。
6．3 根据响应值的标准差和斜率
检测限度（DL）表示为：DL=3.3δ/S
δ：响应值的标准差
S：校正曲线的斜率
斜率S 可从被分析物的校正曲线来估算，δ的值可由多种途径估算。如：
6．3．1 根据空白的标准差
通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小。
6．3．2 根据校正曲线
通过对含有DL 范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标难差或回归线的y 轴截距标准差都可作为标准差。
6．4 申报数据
必须同时提供检测限度和测定检测限度的方法。如果见是根据直观评估或信噪比得来的，应提供相关的一些色谱图。
如通过计算或外推法得到检测限度的估算值，可对一系列接近或等于检测限度样品的逐个分析来论证这一估算值。
7．定量限度
根据检测方法是用非仪器分析还是仪器分析，可用几种方法采评价定量检测限度，除了下面列出的方法外，其他方法也是可接受的。
7．1 根据直观评价
直观评估既可用于非仪器的分析方法，也可用于仪器分析方法。
定量限度一般通过对一系列含有已知浓度被分析物的样品分析，在准确度和精密度都符合要求的情况下，来确定被分析物能被定量测得的最小量。
7．2 根据信噪比
该方法仅适用于出现基线噪音的分析方法。
信噪比的测定是通过比较含有已知低浓度被分析物的样品与空白样品的测定信号，来建立被测物能够准确定量的最小浓度。典型信噪比为10：1。
7．3 根据响应值的标准差和斜率
定量限度(QL)表示九QL＝10δ/S
δ：响应值的标准差
S：校正曲线的斜率
斜率S 可从被分析物的校正曲线估算，δ值的估算可由多种途径得到。如：
7．3．1 根据空白的标准偏差
分析几份空白样品，然后计算其响应的标准差，即可得出分析背景响应的大小。
7．3．2 根据校正曲线
校正曲线的研究应通过对几份含有QL 水平被分析物的样品的测试来进行。回归线的剩余标准差或回归线的y 轴截距标准差都可作为标准差。
7．4 申报数据
应提供定量限度及其测定方法；
可通过分析一系列接近或等于定量限度的样品来论证这一限度。
8．耐用性
在研制阶段应对耐用性进行评估，它取决于所研究的分析方法的类型，并能表明方法参数在微小变异后分析方法的可靠性。
如果测量结果表明对分析条件的变化是敏感的，那么该分析条件就应适当控制或在方法中预先注明。耐用性评估的结果建立了一系列的系统适用性参数(如分离度试验)，以确保在任何时候使用该分析方法都是有效的。
典型变化的例子：
—分析溶液的稳定性，
—提取时间。
在液相色谱条件下的典型变化例子：
—流动相pH 值变化的影响，
—流动相组分变化的影响，
—不同柱子(不同的批号和/或供应商)，
—温度，
—流速。
在气相色谱条件下的典型变化例子：
—不同柱子(不同的批号和/或供应商)，
—温度；
—流速。
9．系统适用性试验
系统适用性试验是许多分析方法的组成部分，它对由分析设备、电子仪器、实验操作和被分析样品组成的完整的系统制行评估。根据被论证的方法类型，对某一特定方法建立系统
用性试验参数。进一步信息可参考药典。