生物等效性试验是新药研发过程中评价药品质量和桥接安全性、有效性数据的重要手段。在生物等效性试验中，一般通过比较受试制剂和参比制剂的相对生物利用度，根据选定的药动学参数和预设的接受限，对两者的生物等效性做出判定。血药浓度-时间曲线下面积(area under the curve, AUC)反映暴露的程度，峰浓度(Cmax)和达峰时间（Tmax）是受到吸收速度影响的参数。如果含有相同活性物质的两种药品药剂学等效或药剂学可替代，并且它们在相同摩尔剂量下给药后，生物利用度(吸收速度和程度）落在预定的接受限度内，则被认为生物等效。设置这些限度以保证不同制剂中药物的体内行为相当，即两种制剂有相似的安全性和有效性。

《中华人民共和国药典》2015年版第4部《药物制剂生物利用度和生物等效性指导原则》指出：对于高变异性药物，如果认为Cmax差异较大但对于临床的影响不大，基于临床的充分理由，则可放宽接受范围，Cmax的可以接受的最宽范围为69.84%~143.19%。2015年CFDA颁布的《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》指出：对于高变异药物，可根据参比制剂的个体内变异，将等效性评价标准作适当比例的调整。国内对于高变异药物生物等效性评价尚无专项的指导原则 , 黄钦等指出高变异药物的生物等效性试验是一个比较复杂的问题，同时也是一个引人关注的现实课题。本文参考国内外法规、指导原则及文献，旨在对高变异药物生物等效性试验及量化评价进行系统阐述。

1.高变异药物生物等效性问题的复杂性

1.1高变异药物的定义

高变异药物(highly variable drug)是指有一个或多个生物等效性评价指标的个体内变异性(within-subject coefficient of variation，CV)≥30%的药物制剂。FDA统计的2003年到2005年之间212项生物等效性试验中有33项高变异性药物。如果采用常规例数的受试者评价会造成把握度太小，II类错误的可能性大，容易把等效制剂判为不等效。不采用大量受试者很难去评价高变异药物的生物等效性，但入组较多的受试者首先会带来伦理学的问题，健康受试者无法从试验中受益，其次增加了试验成本和试验运行管理的难度(因试验条件的限制不能同时入组全部受试者，临床操作可行性降低)。

图1显示了两种药物的生物等效性结果，药物A是正常变异，药物B的个体内变异较大，图中 X轴上80%~125%代表着生物等效限，这两个生物等效性研究中，参比与受试制剂药动学参数（Cmax、AUC）的几何均数比（GMR）均接近于1，对于药物A， GMR的90%置信区间在生物等效限范围内，等效性成立。而药品B，其GMR的 90%的置信区间不符合生物等效限，等效性不成立。虽然药物B的 GMR接近于1，说明试验制剂可能是一个基于良好设计，在体内与参比制剂行为一致的产品，但必须增加受试者例数才能使药品B符合生物等效限。

1.2 造成高变异的相关因素

大部分高变异药物为生物药剂学分类中的2类或4类，这类药物具有溶解度低、首过效应大、生物利用度低、酸不稳定性高、亲脂性高等特性。除了药物本身的因素，制剂因素和饮食时间也可影响药物的变异性，这些药物的血药浓度非常的低，在这种情况下，准确地描述药代动力学参数难度较大。常见的高变异药物包括抗抑郁药阿弋美拉汀、激素类药物黄体酮、钙通道阻滞剂维拉帕米等。

高变异仿制药物的申请可能会因一次失败的生物等效性试验不予批准，需要重复多次体内生物等效性试验直至达到要求。这不仅仅会带来伦理问题，而且会增加药物研发的成本，最终将会加重病人的用药成本。如果采用常规例数的受试者评价会造成把握度太小，II类错误的可能性大，采用常规的双交叉试验设计和80%~125%的生物等效限，两周期均服用参比制剂，都有可能得到不等效性结论，这种情况已经在氯丙嗪和维拉帕米的生物等效性试验中被证实。由此可见，普通的法规已不适用于高变异药物生物等效性试验。

2.国际上关于高变异药物采纳的法规

关于高变异药物生物等效性方法的探讨在国内国际会议中讨论了很多年。2004年，FDA考虑是否对于高变异药物采纳一种固定的方法进行评价。同年4月，FDA仿制药部门（FDA’s office of generic drugs ,OGD)成立了关于高变异药物生物等效最优方案研究的临床药学咨询委员会。随后收集了关于高变异药物解决方法的各种提议，包括采用重复交叉设计、多剂量稳态评价、成组序贯研究等。最后经过筛选考虑采纳用重复参比制剂法计算个体药代动力学参数变异性，等效限80%~125%扩大到70%~143%。FDA的仿制药物部门随后做了仿真研究来验证方案是否可行，并成立了一个工作小组去研究参比制剂校正的平均生物等效性方法。基于仿真研究的结果，在2006年4月工作小组提出了参比制剂校正的平均生物等效性试验方案。FDA的仿制药部门经多方面考虑最终决定对高变异药物采用参比制剂校正的平均生物等效性试验方案。并于2010年发布了第1个属于高变异药品(黄体酮胶囊)的生物等效性试验指导原则(草案)。在FDA提出方案之后，EMA于2010年也出台了相应的高变异药物生物等效性试验的法规。均利用参比制剂的个体内变异对参数生物等效限作比例化调整，均要求对参比制剂是重复设计。下面我们具体介绍两个权威指南中生物等效限界值调整的公式以及相应样本含量的估算方法。

2.1  FDA对于高变异药物生物等效性试验采纳的方法

　　

参比制剂校正的平均生物等效性(reference-scaled average bioequivalence，RSABE)对于AUC和Cmax等效性评估如下式1：  

 ..........(1)

µT为受试制剂药动学参数对数转化后的群体均值，µR为参比制剂药动学参数对数转化后的群体均值，σWR代表参比制剂的个体标准差，θS=（ln1.25)2 /σ2WO，并且σWO是管理机构（regulatory agency）预先设定的常数。在这个模型中μT-μR的等效限如式2：

 ..........(2)

FDA将σWO的值设为0.25。 FDA随后对此方案提出了2点补充说明：

（1）当σWR大于或等于0.294（即CV≥30%)时采用比例均化生物等效性。

（2）点估计的范围在0.8~1.25，即要求Cmax和AUC的GMR在0.8~1.25范围内。使用点估计范围会提高医生和患者对仿制药品的信任。

2.2 EMA

当参比制剂的个体变异大于或等于预先设定的值(CVWR为30%，即个体内标准差SWR=0.294）时，可以用以下公式（3）比例化。

..........(3)

σWO是预先设定的标准差，由监管机构设置。SWR代表参比制剂的个体内标准差，与FDA提出的公式σWR是相同参数。-0.223和+0.223即为ln0.8和ln1.25，这意味着可根据SWR值的大小来相应扩大生物等效限。在公式4 中将0.223/σWO是定义为常数k。：

 ..........(4)

　　个体内变异系数和参比制剂个体内标准差的换算公式见公式5：

..........(5)

EMA设定σWO = 0.294，根据公式4可计算常数k为0.760。EMA规定的扩大的生物等效限公式如式6：

.......(6)

2.3  EMA和FDA的对比

图2 FDA和EMA生物等效限随个体内变异系数变化对比

 

相同点：对比FDA和EMEA两个权威指南，都是根据参比制剂的个体内变异性对生物等效限范围进行调整；均要求对参比制剂是重复设计，部分重复三周期三序列设计（TRR、 RTR、 RRT）、完全重复四周期两序列设（TRTR、RTRT）都是可接受的；两指南均要求参数的GMR仍必须落在传统的等效限范围内（80.00%~125.00%）。

区别：（1）2010年EMA规定的指南更倾向于3周期试验[17]，认为4周期唯一的优点是能够计算试验组的变异性，但是试验组的变异性在提出的方法中不被用到。这种对3周期重复设计的倾向性在FDA指南中没有被提及。（2）比较公式（2）和（3），差别仅在于对σWO设定的不同，FDA是根据数理仿真模拟，将常数σWO设为0.25，而EMA将σWO设为0.294。 （3）FDA规定可将RSABE等效置信区间的调整应用于参数AUC和Cmax。而EMA只将RSABE等效置信区间的调整应用于Cmax。（4）FDA规定由变异系数从30%开始使用这个方法，且σWO设为0.25，故变化曲线是不连续的。这与EMA提出的RSABE方法不同，EMA设定的σWO值为0.294（当变异系数为30%，计算的σWR值为0.294），变化曲线是连续的。（5）EMA采用RSABE等效置信区间的调整最宽只到69.84%~143.19%，当CV超出50%，CV升高，但置信区间不再放宽，而FDA中没有这一限制。图3中可以看出FDA规定的生物等效限范围要比EMA规定范围要宽。

2.4  国际指南对于高变异药物的相似和不同点

各国在法规中用各种各样的方法减少高变异药物生物等效性试验中受试者例数的选择。日本、新加坡、东盟世界卫生组织的相应指南中建议采用稳态的生物等效性试验减少变异性，日本法规同时提出可对高变异药物采用稳定同位素的方法，但这或许需要大量的受试者例数。EMA和美国FDA指南推荐使用参比制剂校正的平均生物等效性试验，用RSABE这种方法，参比制剂必须服用2次来确定个体内变异性，等效限的范围随着参比制剂的个体内变异而定。另外，EMA法规只在Cmax中采用RSABE，而美国法规对于AUC和Cmax都采用RSABE。澳大利亚采用EMA的方法。加拿大法规没有刻意区分高变异药物。

3.高变异药物生物等效性试验样本含量问题

3.1  FDA和EMA关于样本量估算

随着个体变异性的增加，在交叉设计中的受试者例数也要相对增加。假设其他因素保持不变，因此，生物等效性试验样本含量估算取决于检验水准、检验效能、药代参数指标（AUC、Cmax 等）的个体变异和试验药和参比药待评价药代参数指标的差值及设定的等效限值。如下式7：

 ..........(7)

ne：两周期交叉试验所需要的样本例数

n：预试验的样本量

CV：变异系数

v：生物等效限（以对数值表示）

δ：试验制剂与参比制剂的差异（以几何均数比的对数值表示）

α：检验水准，又称显著性水平，通常取5%，是犯第I类错误的概率。

β：β是犯第Ⅱ类错误的概率，也就是把实际有效误判为无效的概率。1-β表示检验效能；即把握度的大小，一般不小于80%。

　　

可根据ne结果来估计参比制剂重复设计的BE研究样本量，其中部分重复的三周期设计样本量一般为ne的四分之三，而完全重复的四周期试验设计样本量一般为ne的二分之一。

计算步骤如下：

（1）计算参比制剂个体标准差SWR，可用以下公式8计算：

 ..........(8)

（2）根据前面公式2或公式6计算生物等效限；

（3） 根据公式9和10分别计算EMA和FDA的以对数值表示的生物等效限；

     v=0.76*SWR..........(9)

     v=0.893*SWR..........(10)

（4）δ分别用公式11计算；

    δ=|ln(GMR)|..........(11)

（5）代入二周期交叉实验公式7即可得ne；

（6）据具体试验设计类型估计样本量。

参考Phani文献中给出的表格，本文给出了80%检验效能四周期试验试验样本含量估算的表格，按EMA和FDA指南要求80%检验效能四周期交叉试验样本含量估算表分别见表2和表3，三周期样本量可根据公式自行推算。文献21中还提供了90%检验效能三周期或四周期重复试验样本含量估算表格，读者可根据需要自行参考。

表2  FDA关于四周期试验样本含量估算

表3  EMA关于四周期试验样本含量估算

3.2  FDA和EMA样本估算的区别与联系

从上述表格可以发现FDA相较于EMA需要受试者例数更少。FDA更有利于申办方的需求，图3是FDA和EMA在变异系数大于等于30%时的样本含量需要。图3也显示了在变异度小于30%的样本含量估算，在变异系数小于30%，样本含量随着变异系数增加而增加，变异度超过30%采用比例化平均生物等效性方法，当GMR=1.0时，样本含量变化很小。当GMR偏离1.0，例如1.1时，样本含量随着变异系数增加而减少。

在EMA中当CV=30%时，不管采用平均生物等效性方法还是参比制剂校正的平均生物等效性方法样本含量是不变的。相反，在FDA中当CV=30%的时候，样本含量是变化的，平均生物等效性方法需要的受试者例数是大于比例化平均生物等效性方法的。FDA提出的法规可能对于高变异药物存在更大的消费者风险。

由FDA和EMA提出的样本含量估算的特征进一步可发现，两样本含量的差异随着变异度的增加而减少。是因为在FDA中几何均值比限度影响等效限范围比EMA的大。当变异度大于50%时，EMA中随着变异度的增加样本含量增加的速度是高于FDA的，因为EMA中变异度大于50%时，生物等效限是不变的，而FDA没有这样一个限制。

图3 FDA和EMA样本含量随个体内变异系数变化的比较图

3.3样本估算举例

高变异药物生物等效性试验样本含量估算问题同样是一个复杂且迫切的现实问题，本文参考Phani提出的样本含量估算方法，给出了公式法、查表法及软件法三种方法解决高变异药物进行生物等效性试验需要的样本例数问题。以下提出一个假设并且给出了样本估算方法实例。

【实例】  假如在进行一个试验药物的BE预试验中，预试验的样本数是12例，得到参数Cmax的个体内变异系数CV为0.32，预试验得到的Cmax的几何均数比为0.95，那么如果进行一个四交叉（α为0.05、β为0.20）的BE正式研究，至少需要多少样本量。

根据公式计算步骤如下：

根据FDA的法规要求：

• 已知：CV=0.32   

• 由公式8可得到SWR=0.312

• 由公式2可得到BE等效界值可放宽至[0.757 ,1.32]

• 由公式10、11可得到V=0.892*0.312=0.278

• δ =|ln(0.95)|= 0.0513

• t(α,2n-2),t(β,2n-2)值分别为1.71、0.858

• 用公式即得到ne=25.973≈26

• 由于是四周期交叉试验  故n≈13

• 同理根据EMA的法规要求：

• 用公式即得到ne=39.245

• 由于是四周期交叉试验  故n≈20

• 所需样本含量为20。

• 查表2和表3可知：

• 当CV=32%时

• 查FDA关于四周期试验试验样本含量估算表格可知：n=13  与计算结果一致

• 查EMA关于四周期试验试验样本含量估算表格可知：n=20  与计算结果一致

我们也可通过一些统计学软件来对样本量进行计。PASS， nQuery，S + 和 SAS 等软件都可计算生物等效性试验的样本量。下面以PASS为例，介绍通过软件计算的步骤。我们仍是通过两周期双交叉试验设计的样本量来估算估计参比制剂重复设计的BE研究样本量。

运行PASS软件，选择“means” → “two means”→“2×2Cross-Over designs” → “Equivalence Tests using Ratios”出现如图4所示窗口，然后在“find（solve for）”选择“N”，即计算样本含量；选择power=0.8、α=0.05；RU（等效标准上限）选择1.321（根据公式2算出），RL（等效标准下限）选择0.757（根据公式2算出）；R1（True Ratio）为0.95；COV（Coefficient of Variation，变异系数）填入0.32。选择或填好以上数字后，单击“run”运行。运行结果如图5所示，按FDA等效限计算2周期样本含量估计结果为27例，四周期即为13例。

如上法按EMA等效限范围RU（等效标准上限）选择1.268（根据公式2算出），RL（等效标准下限）选择0.789（根据公式2算出）如图6计算2周期样本含量为38例，四周期为19例。与公式法和查表的结果基本一致。

图4 根据FDA规定的等效限计算的样本含量结果

 

图5  根据EMA规定的等效限计算的样本含量结果

 

以上三种计算的结果有少许的差异是因为软件样本量估算时没有考虑预试验的例数。药学工作者在以后进行高变异药物样本含量估算时可以参考以上任何一种方法对样本量进行估算。需要注意的地方是，本文介绍的样本量估算是基于统计学考虑所需纳入的最低样本量，在实际方案设计中还应考虑到试验中受试者脱落的可能性，以及药监部门法规所设定的最低样本要求，一般需要筛选适当多一些的受试者入组试验。

综上所述，高变异药物的生物等效性试验评价是一个比较复杂的问题，同时也是一个引人关注的现实课题。FDA和EMA所提出的RSABE法是根据参比制剂个体变异对等效限进行比例化调整，可避免纳入过多受试者参加试验，降低试验成本，提高临床试验的可操作性。但关于具体的高变异药物生物等效性方法国内目前尚无专门的指导原则, 药监部门未出台相应评价细则，还需大量试验基础与理论的结合，需要更加深入细致的研究和探讨。因此注册申请人和临床研究单位在进行生物等效性试验前需要充分掌握受试制剂和参比制剂详细的药物代谢情况及其个体内的变异情况， 判别研究的药物有没有高变异的属性。 如果是高变异药物，还需了解药物的安全范围，如果认为Cmax差异较大对于临床的影响不大，基于临床的充分理由，则可以放宽Cmax等效接受范围，鉴于EMA的方法更加严格，国内申请人在进行高变异仿制药BE研究中应尽量采用EMA的标准，并选择合适的样本含量进行研究。

迫切希望国家有关部门早日出台更加科学规范的指南对高变异药物进行生物等效性试验进指导，为国内临床研究单位解决高变异药物生物等效性研究问题提供可采纳的方法, 从而更加科学可靠地评价高变异药物的生物等效性。